一、項目簡(jiǎn)介

本項目利用角蛋白酶生產(chǎn)菌株降解羽毛蛋白，生產(chǎn)多肽和氨基酸，其工藝簡(jiǎn)便、處理方式溫和、產(chǎn)品性能優(yōu)異。結合項目單位在行業(yè)中的影響力（全國第二）及已有的客戶(hù)群和國內外銷(xiāo)售渠道，本項目的實(shí)施有利于革新生產(chǎn)模式，引領(lǐng)行業(yè)升級，擴大市場(chǎng)占有率，同時(shí)實(shí)現廢棄物資源化與環(huán)境治理、使農業(yè)增效、農民增收。本項目將發(fā)酵工程技術(shù)與裝備應用于羽毛多肽和氨基酸生產(chǎn)中，對促進(jìn)禽類(lèi)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有引領(lǐng)和示范作用，也為自動(dòng)化控制在該行業(yè)的應用、實(shí)現工業(yè)4.0奠定了堅實(shí)的基礎。

二、主要技術(shù)路線(xiàn)和實(shí)施方案及開(kāi)發(fā)過(guò)程總結

（1）技術(shù)路線(xiàn)：

①基于提升角蛋白酶活性與底物特異性的生產(chǎn)菌株分子改造與酶的改性

目前角蛋白酶的生產(chǎn)應用尚存在底物專(zhuān)一性較差、水解底物效率不高等問(wèn)題，在一定程度上阻礙了角蛋白酶的應用潛力，且酶活水平尚有進(jìn)一步提升空間。本項目通過(guò)角蛋白酶結構預測與解析，運用定點(diǎn)突變、定向進(jìn)化等手段，以及角蛋白酶基因簇組裝技術(shù)，獲得高活性、高底物特異性的角蛋白酶工程菌株。預期角蛋白酶酶活達到 4500 U/mL，提取總收率65%以上。

②基于生產(chǎn)菌株代謝特性的發(fā)酵條件優(yōu)化與羽毛降解能力控制

結合角蛋白酶生產(chǎn)菌株菌體生長(cháng)與產(chǎn)酶生理特性，通過(guò)培養條件的多變量?jì)?yōu)化控制技術(shù)及分階段培養控制技術(shù)，優(yōu)化生產(chǎn)菌株的羽毛降解能力，進(jìn)一步縮短生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)強度，逐步優(yōu)化產(chǎn)品放大生產(chǎn)工藝。

③基于水解效率及產(chǎn)物成分分析的羽毛水解生產(chǎn)多肽和氨基酸性能評價(jià)與方案優(yōu)化

通過(guò)改造菌株和角蛋白酶分子來(lái)實(shí)現對羽毛等角蛋白廢棄物的高效水解，實(shí)現飼料多肽與目標氨基酸的高效生產(chǎn)。根據水解效率與水解產(chǎn)物成分分析，通過(guò)酶解工藝控制，開(kāi)展角蛋白酶生產(chǎn)菌株的應用性能評價(jià)，優(yōu)化水解產(chǎn)物中多肽與目標氨基酸的產(chǎn)物配比，提升底物轉化率至5%以上。

④高純度多肽和氨基酸產(chǎn)物高效分離系統及閉路循環(huán)清潔生產(chǎn)體系的構建

應用陶瓷膜、納濾膜與結晶/工業(yè)色譜分離相結合的方法實(shí)現多肽和目標氨基酸的高效分離。水解液以批次方式進(jìn)入閉路循環(huán)，經(jīng)陶瓷膜過(guò)濾除菌、納濾膜截留多肽、活性炭吸附脫色、濃縮液等電結晶離心/工業(yè)色譜分離獲得目標氨基酸，剩余的少量廢液處理后可獲得有機無(wú)機混合肥料。閉路循環(huán)清潔生產(chǎn)體系構建如下：

（2）實(shí)施方案及開(kāi)發(fā)過(guò)程：

①項目產(chǎn)品可以替代魚(yú)粉應用于飼料行業(yè)。本項目的角質(zhì)蛋白酶解生產(chǎn)多肽和氨基酸的中試技術(shù)已經(jīng)成熟，目前已有新沂市佳威飼料有限公司、寧波隆鑫生物科技有限公司等客戶(hù)訂貨；項目產(chǎn)品一旦規?；a(chǎn)，即可迅速擴大市場(chǎng)。

②國內市場(chǎng)對多肽和氨基酸需求量大，應用范圍廣。以國內市場(chǎng)銷(xiāo)售為主，在細分市場(chǎng)的基礎上，確定重點(diǎn)區域，尋求其突破口。確定以長(cháng)三角、珠三角、東北三省、青海、西藏、新疆地區為主，以替代飼料魚(yú)粉等領(lǐng)域為突破口，有序推進(jìn)，定位幾家知名企業(yè)用戶(hù)，形成示范效應，以點(diǎn)帶面，發(fā)展一片成熟一片，逐步推向全國市場(chǎng)。

③針對國際市場(chǎng)，目前對多肽和氨基酸需求量較大的國家和地區主要有美國、泰國、越南、日本、印度、俄羅斯、荷蘭、德國、印度尼西亞和韓國等，公司將突出產(chǎn)品的技術(shù)優(yōu)勢，質(zhì)量?jì)?yōu)勢，成本優(yōu)勢，通過(guò)國際展覽，洽談會(huì )議、電子商務(wù)、國外代理等方式，拓展國際市場(chǎng)，穩步增加出口量。

④堅持“誠信守諾”的營(yíng)銷(xiāo)宗旨，整體提升銷(xiāo)售人員的素質(zhì)和業(yè)務(wù)技能，加強產(chǎn)品宣傳、廣告推介、信息發(fā)布，創(chuàng )新銷(xiāo)售理念，主動(dòng)為客戶(hù)籌劃，搶占市場(chǎng)空間。以江南大學(xué)為技術(shù)依托，對現有客戶(hù)與潛在用戶(hù)進(jìn)行技術(shù)指導，提供一條龍增值技術(shù)服務(wù)，擴大競爭優(yōu)勢。

三、本技術(shù)（產(chǎn)品）與同類(lèi)領(lǐng)先水平技術(shù)（產(chǎn)品）的對比分析報告

1、本領(lǐng)域技術(shù)（產(chǎn)品）國內外現狀

（1）角蛋白酶的開(kāi)發(fā)及應用

在產(chǎn)角蛋白酶菌株的選育工作中，美國學(xué)者Lin等篩選獲得的Bacilus licheniformis PWD-1是研究最早的產(chǎn)角蛋白酶菌株。此后印度人Gupta和我國學(xué)者曹張軍等先后從B.licheniformisER-15 、S.maltophiliaDHHJ等菌株中分離獲得一系列角蛋白酶。堵國城團隊篩選得到的角蛋白酶生產(chǎn)菌株Bacillus licheniformis BBE11-1e和Stenotrophomonas maltophiliaBBE11-1所產(chǎn)角蛋白酶對羽毛、羊毛角蛋白均有高效降解能力。

目前國內外對角蛋白酶的分子改造鮮見(jiàn)報道。堵國城團隊通過(guò)角蛋白酶KerSMD的C端架構改造、N/C端結構互換、底物結合口袋特殊氨基酸突變等策略，篩選到摧化效率高、底物專(zhuān)一性強、耐熱的角蛋白酶突變株。

對角蛋白酶的發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化研究主要由我國學(xué)者Wang、蔡成剛等通過(guò)培養基優(yōu)化，分別將重組枯草芽孢桿菌的角蛋白酶產(chǎn)量提高至304和124.8U/ML。堵國城團隊通過(guò)分階段溫度控制、底物流加等發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化控制策略，將該酶活性穩定在3000U/ml以上，為目前報道的最高水平。

雖然國內外學(xué)者軍隊角蛋白酶進(jìn)行了較多的研究，但具有代表性的商品角蛋白酶仍掌握在BRI、Protes Biotech、Genentech等幾家國外公司手中，用于動(dòng)物飼料和醫療領(lǐng)域。

（2）羽毛生產(chǎn)多肽和氨基酸

經(jīng)粉碎法加工的羽毛粉中可被畜禽利用的蛋白不足10%，而其水解液因含有大量的多肽和氨基酸，基本能被動(dòng)物吸收利用。采用加壓法或酸堿法制備羽毛多肽和氨基酸因其工藝條件的限制，僅能以鴨毛、鵝毛為原料，產(chǎn)品存在設備要求高，生產(chǎn)過(guò)程能耗大，轉化率低，處理成本高、產(chǎn)物單一及穩定性差等缺點(diǎn)。

本項目以角蛋白酶生產(chǎn)菌株對羽毛的高效降解能力為基礎，利用多種禽類(lèi)羽毛生產(chǎn)多肽和氨基酸，無(wú)需復雜的前處理，生產(chǎn)過(guò)程溫和，不僅保持了多肽的活性和氨基酸的豐富性，同時(shí)酶解反應溫和，無(wú)污染，這將是行業(yè)發(fā)展的必然趨勢。

2、目標產(chǎn)品處于產(chǎn)業(yè)鏈重要環(huán)節的闡述

目標產(chǎn)品以羽毛為原料，可解決禽類(lèi)產(chǎn)業(yè)鏈上游加工時(shí)廢棄物的資源化利用及環(huán)節污染問(wèn)題。生成的多肽和氨基酸可替代魚(yú)粉、豆粕等，以此生成的蛋白飼料成本低、添加量少、吸收轉化率高。同時(shí)多肽中含有抗菌肽，可減少抗生素使用，促進(jìn)生態(tài)養殖，提高肉品質(zhì)量。此外，提取產(chǎn)品后的廢液可用作土壤改良劑，使農業(yè)增效。

3、可實(shí)現的重大技術(shù)突破及對產(chǎn)業(yè)結構調整和整體水平提升作用

羽毛是禽類(lèi)加工時(shí)產(chǎn)生的副產(chǎn)物，我國每年產(chǎn)品近120萬(wàn)噸。僅江、浙、皖三省的羽毛集散地每天吞吐量2000噸左右。禽類(lèi)養殖亦是蘇北市縣特色產(chǎn)業(yè)，新沂市每年家禽宰殺量2500萬(wàn)羽左右，產(chǎn)生羽毛約5000噸，羽毛中除鴨毛、鵝毛制取少量羽絨外，其余作為廢棄物，造成資源浪費和環(huán)境污染。

羽毛中蛋白含量高達85%-90%，其水解產(chǎn)物與豆粕、魚(yú)粉等畜禽日糧媲美，且原料來(lái)源廣、利用率高、產(chǎn)品價(jià)格低。目前用羽毛制備多肽和氨基酸的方法主要為高溫高壓和酸堿法，但存在生產(chǎn)過(guò)程能耗大、處理成本高、產(chǎn)物單一及穩定性差等缺點(diǎn)。同時(shí)水解法僅局限于處理鴨毛、鵝毛，而對羽毛中占主導地位的雞毛尚無(wú)適用的工藝，已成為拓展羽毛資源利用的瓶頸。

本項目利用角蛋白酶生產(chǎn)菌降解羽毛蛋白，生產(chǎn)多肽和氨基酸，其工藝簡(jiǎn)便、處理方式溫和、產(chǎn)品性能優(yōu)異。結合項目單位在行業(yè)中的影響力（全國第二）及已有的客戶(hù)群和國內外銷(xiāo)售渠道，本項目的實(shí)施有利于革新生產(chǎn)模式，引領(lǐng)行業(yè)升級，擴大市場(chǎng)占有率，同時(shí)實(shí)現廢棄物資源化與環(huán)境治理、使農業(yè)增效、農民增收。本項目將發(fā)酵工程技術(shù)與裝備應用于羽毛多肽和氨基酸生產(chǎn)中，對促進(jìn)禽類(lèi)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有引領(lǐng)和示范作用，也為自動(dòng)化控制在該行業(yè)的應用，實(shí)現工業(yè)4.0奠基了堅實(shí)的基礎。

四、技術(shù)需求

（1）基于計算流體力學(xué)模擬的角蛋白酶發(fā)酵過(guò)程放大技術(shù)

通過(guò)流場(chǎng)分布與流體力學(xué)計算，研究大罐中角蛋白酶發(fā)酵體系的動(dòng)量傳遞、熱量傳遞和質(zhì)量傳遞的特點(diǎn)，優(yōu)化發(fā)酵罐結構與操作參數，強化動(dòng)量傳遞、熱量傳遞和質(zhì)量傳遞，降低流場(chǎng)變化和不均一性對角蛋白酶大罐發(fā)酵過(guò)程的影響。在此基礎上，確定菌體生長(cháng)、角蛋白酶表達的關(guān)鍵時(shí)間節點(diǎn)，進(jìn)而綜合優(yōu)化，在大罐水平上對角蛋白酶合成、成熟及穩定化進(jìn)行精確調控，在大罐中高效生產(chǎn)角蛋白酶。

（2）基于發(fā)酵動(dòng)力學(xué)特征的角蛋白酶發(fā)酵過(guò)程智能控制技術(shù)

針對角蛋白酶發(fā)酵過(guò)程的特點(diǎn)，綜合利用過(guò)程參數、數據采集與處理技術(shù)、過(guò)程控制模型優(yōu)化與控制執行、信息流處理、分析、通訊與管理技術(shù)，獲取的微生物本征動(dòng)力學(xué)與宏觀(guān)動(dòng)力學(xué)過(guò)程參數。利用數據挖掘的方法提取上述參數的內在聯(lián)系，修正現有過(guò)程數學(xué)模型，并設計或集成相關(guān)軟件?；谝陨蠑祵W(xué)模型，對可能影響反應的控制系統故障進(jìn)行在線(xiàn)診斷和早期預警，保證發(fā)酵反應在設定的理想環(huán)境水平下進(jìn)行。

（3）基于酶解羽毛的多肽和氨基酸工業(yè)規模高效生產(chǎn)

針對酶解羽毛過(guò)程中實(shí)時(shí)產(chǎn)物分析結果，根據多肽分子量分布范圍和時(shí)間以及目標氨基酸產(chǎn)量變化規律制定相應的生產(chǎn)策略，達到多肽和氨基酸產(chǎn)品產(chǎn)量的最大化。針對工業(yè)化大規模生產(chǎn)中可能出現的問(wèn)題，為了保證產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)效率，需要進(jìn)一步研發(fā)傳感器技術(shù)對酶解過(guò)程中底物、中間產(chǎn)物和目標產(chǎn)物的信息變化進(jìn)行實(shí)時(shí)的監測，建立酶解生產(chǎn)過(guò)程的自動(dòng)取樣，樣品自動(dòng)稀釋和自動(dòng)分析測定系統，實(shí)現多肽和氨基酸的高效生產(chǎn)。

（4）基于高效膜分離與清潔生產(chǎn)的多肽和氨基酸分離提取技術(shù)

將公司已建立的多肽和氨基酸中試提取工藝放大至工業(yè)規模，重點(diǎn)進(jìn)行兩方面研究：1) 優(yōu)化超濾工序的操作參數和抗污染膜組件，提高分離膜的選擇性、通量、抗污染能力及使用壽命，開(kāi)發(fā)高效膜污染控制技術(shù)；2) 充分利用酶法水解羽毛生產(chǎn)多肽和氨基酸過(guò)程中可能產(chǎn)生的廢棄物，讓整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程零污染、零排放。